27岁得知将患绝症，这对夫妇转行读博自救：如今他们的研究成果发表于《科学》
瓦拉布夫妇和他们的女儿，右图女儿手中拿着的是外婆卡姆尼的照片（图片来源：Ethan Hill）
技术前沿，故事动人。
撰文 | 黄雨佳
审校 | clefable
或许你对“疯牛病”一词并不陌生，这是一种朊病毒病，由蛋白质构象异常引起。一些错误折叠的蛋白质会影响正常蛋白质的构象，并将它们也“同化”成朊病毒，使得朊病毒最终像流水般扩散至牛的整个大脑。人类如果食用这些病牛的感染组织，也可能感染并患病。然而，对于一些人，朊病毒不是靠“管住嘴”就能规避的，因为它已然藏在他们的基因组中：有大约15%的人类朊病毒病是遗传型朊病毒病。
朊病毒蛋白（PrP）是人体内天然存在的蛋白质，可能在神经元发育等过程中发挥作用。然而，当编码朊病毒蛋白的基因PRNP发生突变时，就可能引起克罗伊茨费尔特-雅各布病（CJD）和致死性家族性失眠（FFI）等多种人类的朊病毒病。这些基因突变几乎都是常染色体显性遗传，因此，对于携带这些基因突变的人而言，如果没有合适的疗法，人生几乎就是一步步向着疾病走去。
PRNP基因突变导致的部分朊病毒病（图片来源：UniProt）
不过，今天发表在《科学》（Science）上的一项研究或许给他们带来了曙光。美国麻省理工学院和博德研究所（Broad Institute）的研究人员开发了一种新的疗法，通过关闭大脑中突变的PRNP基因，停止大脑中错误构象蛋白质的表达，从而减少毒性蛋白质的积聚。
新技术带来曙光
在各种朊病毒病中，朊病毒蛋白是唯一的病发因素。由于这种疾病进展极快，因此最好的办法就是在疾病发展之前采取行动，减少大脑中朊病毒蛋白的数量。对于这种病因明确的遗传性疾病，研究人员希望直接通过基因沉默的方式来解决问题。
朊病毒蛋白（图片来源：PoopAcidMaker, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons）
在人体内，基因启动子区域中的碱基甲基化是一种天然的沉默基因表达手段。因此，2021年，科学家开发了一种基于CRISPR技术的基因沉默方法，将没有DNA切割活性的Cas蛋白与DNA甲基转移酶相连，实现DNA的定点甲基化，用来沉默特定的基因。
然而，要想将这种疗法应用于动物甚至人体内，目前药物递送的手段还达不到要求。常用于基因递送的腺相关病毒（AAV）太小了，一个AAV无法同时装下Cas蛋白、DNA甲基转移酶以及用于定位的指导RNA（gRNA）的基因。倘若用多个AAV分开包装，就意味着达到相同递送效果，就需使用更高浓度的AAV载体，相应的副作用和风险也会更高。
为了解决这一问题，研究人员想出了一个妙招：既然DNA甲基转移酶是人体内本来就有的东西，我们为何还要额外递送呢？直接使用内源的甲基转移酶，然后定点激活不就可以了吗？
沿着这样的思路，研究人员将原来方法中的甲基转移酶换成了D3L结构域和组蛋白H3的尾部，它们分别能招募和激活内源的DNA甲基转移酶。此外，研究人员还将原本的Cas蛋白换成了锌指蛋白，它无需gRNA的协助就能定位特定DNA序列，而且比Cas蛋白更小。就这样，一个全新的表观遗传编辑器——CHARM（Coupled Histone tail for Autoinhibition Release of Methyltransferase，意为“用于甲基转移酶自抑制释放的偶联组蛋白尾部”）——诞生了。
朊病毒蛋白（图片来源：NIAID, CC BY 2.0, via Wikimedia Commons）
动物实验结果显示，当通过静脉注射将携带有CHARM的AAV递送至小鼠全身时，这种编辑器能在PRNP基因的启动子区域引入甲基化，沉默该基因，使得小鼠全脑神经元中的朊病毒蛋白减少80%。而之前的研究已经表明，只需减少小鼠模型中21%的朊病毒蛋白，就已足够改善相应疾病症状，延长朊病毒病模型小鼠的生存期。此外，CHARM在小鼠模型中的毒性和脱靶效应也很低。
相比于之前基于CRISPR的方法，CHARM在许多方面都体现出了优势：由于是定点激活内源DNA甲基转移酶，编辑器的细胞毒性极大程度地减低了；由于编辑器十分小巧（这意味着编码编辑器的基因很短），一个AAV载体中可以装入靶向最多3个不同基因组区域的编辑器；也正因如此，研究人员得以在AAV中同时装入沉默PRNP基因的编辑器和沉默编辑器自身的编辑器，避免了编辑器在体内长期表达可能带来的风险。
背后的动人故事
然而，在这样前沿的发现背后，却有一个令人落泪的故事。这篇文章的通讯作者之一是索尼娅·米尼克尔·瓦拉布（Sonia Minikel Vallabh），她正是一位携带有PRNP基因突变的患者。
2010年2月，瓦拉布51岁的母亲卡姆尼（Kamni）出现了视力模糊的症状，而仅仅一个月后，她的认知能力也出现了飞速下滑。到了那年5月，卡姆尼已经有超过一半的时间认不出家人，也丧失了行走能力。情况继续急转直下，2010年12月，卡姆尼在经历了漫长而痛苦的疾病挣扎后去世了。
医生一直没能诊断卡姆尼所患疾病，直到2011年底，瓦拉布和家人才得知，尸检结果显示卡姆尼患有致死性家族性失眠。通过进一步筛查，27岁的瓦拉布得知自己也从母亲那儿遗传了相应的朊病毒蛋白基因突变——PRNP D178N。这意味着她几乎肯定也会患上同样的疾病。
瓦拉布夫妇（图片来源：Broad Institute）
从那时起，瓦拉布和丈夫埃里克·瓦拉布·米尼克尔（Eric Vallabh Minikel，也是这篇论文的作者之一）为自己的人生定下了一个新的目标：治疗这种基因突变造成的可怕疾病。一旦他们实现这个目标，就意味着瓦拉布和其他患者的大脑能在几年或几十年间，甚至一辈子都保持健康和完整的大脑功能。而任务失败则意味着在瓦拉布最好的年华里，她可能一夜之间就会被疾病击倒，并在出现症状的几周内遭受毁灭性的脑损伤。
于是，夫妻二人放弃了以前的职业，进入夜校学习生物学，并谋取了一个研究性实验室的入门职位。2014年，他们前往美国哈佛大学医学院攻读博士学位，毕业后在博德研究所建立了自己的实验室。
在2019年发表于《美国科学院院刊》（PNAS）的一篇论文中，两人将反义寡核苷酸（ASO）用作了降低大脑中朊病毒蛋白含量的手段。ASO能靶向目标基因翻译出的信使RNA（mRNA），从而阻止生成相应的蛋白质。研究结果显示，这些ASO能显著降低小鼠模型大脑中的朊病毒蛋白水平，延长它们的寿命。
瓦拉布夫妇（图片来源：Ethan Hill）
不过，ASO疗法也有其局限性。这些分子只能短时间降低朊病毒蛋白表达，因此需要反复注射，而且为了达到大脑发挥作用，还需反复鞘内注射（通过腰穿等方式给药）。此外，此前的研究也已发现ASO疗法可能存在一些不良反应风险，例如导致脑积水、脑膜炎和肝毒性等。这也是夫妻二人决定继续开发新疗法并最终发明CHARM的缘由。
对于瓦拉布夫妇而言，朊病毒病既是一种死刑判决，但同时又给了他们绝处逢生的机会。他们正是在无路可逃的境遇下才有机会开辟一条以预防疾病为目标的道路，或许他们真的能绝处逢生。
参考来源：
https://www.uniprot.org/uniprotkb/P04156/
https://www.science.org/doi/10.1126/science.adq3334
https://www.science.org/doi/10.1126/science.ado7082
https://www.eurekalert.org/news-releases/1048956
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1901947116
《环球科学》2020年4月刊 《阻击朊病毒》
本文来自微信公众号“环球科学”。如需转载，请在“环球科学”后台回复“转载”，还可通过公众号菜单、发送邮件到[email protected]与我们取得联系。相关内容禁止用于营销宣传。
微信扫码关注该文公众号作者