如何提升国自然标书实验设计的全面性？

4月前

在前面几期我们已经将标书如何推导假说、立项依据怎么写、预实验应该做到什么程度等问题捋了一遍，那么接下来几次交流我们重点就要放在如何验证我们的科学假说这一问题上来。对应到我们的申请书模板中主要就是三块内容：研究内容、研究方案、技术路线。这部分内容主要就是实验设计，要追求研究方案的全面性还要兼具新颖性，也是十分困难的一块内容。今天我们来聊聊如何提升标书的实验设计全面性吧！

标书实验设计全面性就是全方位来验证你所提出的假说，它和我们之前说的假说推导预实验部分最大的区别就是要具体，具体到分子互作相互调控机制；还有就是预实验我们是要尽量控制预算，而研究方案因为是你申请项目下来的经费要做的事情，所以要体现工作量让专家觉得这个方案确实需要足量的经费支持。

但是需要注意的是研究体量不是堆叠实验方法与数据，而是要从多个层面排除干扰项，尽可能得出最可靠的结果，将假说变为结论。有许多人第一次申请项目，研究方案就变成了方法的堆叠，比如证明一个肿瘤转移把能想到的划痕、transwell、3D肿瘤球等实验全部招呼了上去，那这样的方案对于深度验证你的假说有什么用一点用没有。

下面我们就给大家一个具体的全面性验证假说的模式方案供大家参考：

那我们先假定一个假说：A通过XX机制促进B表达进而抑制C通路最终导致D表型发生，D表型发生促进YY疾病的发展；全面的实验方案要按以下展开：

1. 临床层面验证A/B/C信号轴表达水平与YY疾病临床表征的相关性；

2. 细胞层面验证A/B/C信号轴调控D表型发生的功能机制；

3. 分子层面验证A通过XX机制调控B表达促进D表型发生的分子机制；

4. 个体层面验证A/B/C信号轴调控D表型在YY疾病发生中的作用机制；

这里我们要明确几个点：①临床样本如果不好获取就可以不用写；②细胞和动物（个体）层面验证的科学问题是有区别的，细胞层面只能关系到表型，只有个体层面才可以有疾病这个概念；③分子层面其实也是细胞中去做的，这里分开写只是为了平均分配研究方案体量，不然显得细胞实验过于庞大。

然后具体到每一个部分的设计来说要这么来进行：

1. 临床层面：先说明样本采集条件、患者纳入标准、伦理、分组等等基本问题；然后对于A/B/C分子表达、D表型marker进行检测；再将获得的数据与临床指标去做单/多因素回归分析确定相关性即可；

2. 细胞层面：先说明相关细胞系选择和细胞模型获取方法；然后做基础的分子表达、表型检测（除了marker以外还要有显微层次检测等）；再来就是做分子干预了，一般是建立最上游分子A的稳定高表达/低表达细胞（如果A本底表达绝对值就很低那么不用做敲减），这样就分成如下分组-A过表达组、A过表达空载组、A敲减组、A敲减空载组、空白对照组；然后做前序同样的检测；最后根据rescue策略进行功能回复实验即可；功能回复实验的设计必不可少，记住一点逆转前面的操作所造成的结果就很好设计了。比如A分子过表达促进了B分子的表达，那么我们在A过表达的细胞里面转入B分子敲减载体，看看下游C通路和D表型是否发生逆转就可以了；这样把所有排列组合做一下就可以构成一个完整严谨的功能回复实验了；一般的通路抑制剂和激动剂可以去MCE网站搜索一下。

3. 分子层面：这块主要设计分子机制，比如这个假说核心机制肯定是A通过XX机制促进B表达，那么我们首先在上面细胞层面中的细胞里面检测一下XX机制对于B表达的影响，比如泛素化我们可以做一下B的泛素化检测等等；再来就是A和B的分子互作以及互作位点，这里就要看A和B结合的分子状态了，比如A是蛋白B是RNA那么就要用RIP和RNA pull down去做下互作关系，以此类推蛋白和DNA就用ChIP和DNA pull down、蛋白与蛋白用co-IP等，然后用基因点突变技术去破坏A的酶活以及A与B的结合位点，转入细胞后进行基础的分子表达、表型检测；分子机制就验证完成了。

4. 个体层面：这部分其实就比较简单了，构建模型然后取样做检测，和疾病特征、指标做相关性分析；这里要注意的点就是动物模型以及可能的给药方式等选择要有公认性，要么选择传统的，如果用自己摸索的方法要有佐证，比如自己发表过的不错的文章或者国家专利等。

这样整体方案就从“分子-细胞功能-个体疾病发生-临床相关性”得到全面设计和验证。