表观遗传标记揭示肺动脉高压新靶标：组织蛋白酶 Z的作用与影响

今天介绍的这篇论文于2024年1月6日发表在影响因子16.6分的Nature Communications上，文章题为《Blood DNA methylation profiling identifies cathepsin Z dysregulation in pulmonary arterial hypertension（血液 DNA 甲基化分析可识别肺动脉高压中的组织蛋白酶 Z 失调）》。为了解肺动脉高压 （PAH）表观遗传变化的易感性，来自英国的科学家进行了表观全基因组关联研究。该研究的发现指出了表观遗传变异尤其是DNA甲基化改变在PAH中可能的作用，并且揭示了CTSZ与肺动脉高压关联的肯能联系并发现了潜在治疗靶点。

研究背景

肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种罕见且严重的疾病，其特征是肺血管结构的重塑，导致患者因右心衰竭而过早死亡。PAH的年死亡率约为10%，这种情况是由肺部的高血管阻力驱动的。特别是，特发性PAH（Idiopathic PAH, IPAH）常发生于女性，发病率在西方国家每百万人中约有25人，是一种临床上相关治疗方法极为有限的疾病，这反映出我们对PAH分子机制了解的局限性。

骨形态发生蛋白受体2（Bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2）的突变在遗传性PAH个体中约占80%，在特发性PAH中占20%，并且只有约20%的突变携带者显示出疾病。此外，男女发病率的不平衡表明，除了遗传性DNA变异之外，环境以及潜在的表观遗传因素可能对个体的易感性有所贡献。尽管研究显示BMPR2启动子的DNA甲基化在PAH患者中上升，但目前对人类PAH的甲基化图谱还知之甚少。

利用表观基因组关联研究（Epigenome-wide association studies，EWAS）可以从血液中检测出与疾病相关的表观遗传标志，尽管这些不是直接来自肺血管组织，但也能提供有关于血液和血管组织共享的表观遗传变化的见解。

在这个背景下，本研究旨在通过EWAS来确定在广泛定义的PAH个体群体中整体表观基因组特征，并探索这些特性是否在PAH的发展过程中保持不变。研究分析了来自英国特发性及遗传性PAH国家队列研究的外周血样本，并通过将其与三项外部研究的数据整合，达成了更为广阔和准确的研究基础。

样本来源及方法

样本来源：来自英国国家PAH队列以及三个外部队列，包括帕金森病进展标志物研究队列（PPMI)、阿尔茨海默病神经影像研究队列（ADNI）以及北芬兰1966出生队列（NFBC1966）。

全基因组甲基化芯片分析 (EWAS)：使用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片对429例PAH患者和1226名对照个体的外周血样本进行全基因组DNA甲基化水平的分析，针对865,848个CpG位点进行检测。

数据处理和质量控制：利用CPACOR pipeline处理原始甲基化数据，对数据的质量进行控制，并进行标准化处理。使用Houseman方法估计白细胞类型亚群，以及利用EPISTRUCTURE方法计算祖先相关的主成分。

敏感性分析：对关联了PAH的主要甲基化标记进行性别分离的分析，以评估甲基化水平的差异。

数据关联分析：进行DNA甲基化水平与PAH的案例-对照关联分析，考虑性别、年龄、白细胞分数、预测的吸烟状况、控制探针的主要成分和“epi-structure”主要成分等多个变量。

后续转录组和蛋白组学分析：整合转录组数据（采用Illumina Globin-Zero rRNA Removal Kits样本处理并在Illumina测序平台进行RNA-Seq）和蛋白质组数据（SomaLogic SomaScan），关联甲基化信号与基因表达及蛋白质水平的变化。

In vitro细胞实验：在人肺动脉内皮细胞中敲低CTSZ表达，并检测凋亡酶活性、细胞活性、凋亡和增殖反应。

实验方法的优点：

1.  全面性: 允许横跨整个基因组对大量CpG位点进行分析，为发现表观遗传学变化提供了全面的视角。

2.  高通量: 可以一次性对大量样本进行甲基化分析，有效地增加了研究的统计能力。

3.  无创性: 利用外周血样本进行分析，对参与者来说是非侵入性的，有助于样本的收集和参与度的提高。

4.  关联性: 结合转录组和蛋白质组学分析可以进一步验证甲基化改变与基因表达和蛋白质水平之间的关系，提高发现的生物学意义。

结果

图1 DNA甲基化数据的质量控制流程

此图展示了如何处理和质量控制原始的DNA甲基化数据。研究者使用CPACOR流程对PAH队列研究和其他三个外部数据集的数据进行处理。流程包括了对DNA甲基化标记（CpG位点）的质量检查，以及基于一系列参数（如探针控制的主成分和祖先关联的主成分等）对样本进行筛查和过滤。

表1 EWAS 中 PAH 患者的人口统计学和临床特征

表1为我们提供了详细的PAH人群特性和临床特征数据，这些信息对于理解疾病特点、评估治疗反应和展开针对性研究有重要价值。通过这些数据，可以获得关于PAH患者在性别、年龄、疾病严重程度、功能状况、心血管压力、接受治疗类型及种族背景等方面的全面了解。

图2 PAH的表观基因组关联研究 (EWAS)结果

图2以两个子图表现了研究的主要结果。

(a) 曼哈顿图展现了整个基因组中与PAH相关的CpG位点的情况。图中的x轴按照染色体的顺序排列了全部CpG位点，y轴代表每个位点相关性分析的-log10 (P值)。红色的水平线代表显著性阈值，位于此线以上的点标记了那些与PAH有显著关联的CpG位点。有三个CpG标记在调整基因组膨胀之后达到了表观遗传学范围内的显著性（p < 10^-7），而有865个CpG未经校准就达到了提示性阈值(p < 10^-5)。

(b) 通过箱线图展示三个与PAH最显著相关的CpG位点的甲基化水平在PAH患者(429个)和对照组(1226个)间的差异。箱线图中，箱体表示数据分布的四分位范围，中位线代表中位数，触须（whisker）代表正常范围的极限值。该图向我们展示了这些CpG位点在PAH患者中甲基化的显著增加，为进一步分子机制的研究提供了依据。

图3 与PAH强相关的CTSZ基因附近CpG位点的基因组区域

图3展示了位于CTSZ基因上游大约2kb区域的最显著DNA甲基化位点（cg04917472）所在的基因组环境。图中使用不同颜色显示了与此CpG位点相关性不同的其他CpG位点。此外，由epigenomic数据给出的染色体结构特点也呈现在图中，包括在不同细胞类型中（如HMEC和HUVEC）的组蛋白修饰样式（例如，H3K4me1、H3K4me3和H3K27Ac）和基于这些修饰信息预测的基因调控区域（chromHMM）。这张图提供了对于这个区域可能发生的基因调控机制的深入理解，特别是在PAH相关细胞类型中基因表达的潜在调控。

图4 PAH患者中的组织蛋白酶 Z (CTSZ)水平

图4聚焦于CTSZ这一在本研究中发现的与PAH显著关联的基因的不同方面。

图4a 展示了PAH患者中基于CTSZ CpG位点甲基化状态的CTSZ基因表达水平。数据表明，随着甲基化水平的增加，CTSZ的转录水平显著降低，这支持了甲基化水平与基因表达水平呈反向相关的假设。

图4b 通过图示对比，展现了PAH患者血浆中CTSZ蛋白水平较健康对照组显著升高。这个发现提示CTSZ蛋白的变化与PAH的病理有关联，并且指出白细胞中降低的CTSZ蛋白水平并不能完全解释循环中CTSZ浓度的增加。

图4c 利用免疫组织化学染色技术显示了控制组和PAH患者肺组织中的CTSZ表达。免疫组织化学染色表明，CTSZ在病变特征如网状丛状病灶（plexiform lesions）中的表达特别强烈。

图3、图4总结了DNA甲基化水平、CTSZ RNA和蛋白水平在PAH患者中的变化情况，以及这些变化在PAH发病机制中的潜在作用。特别指出了在肺动脉高压患者肺组织中观察到的CTSZ甲基化水平的改变，从而验证了这一点作为疾病标志和潜在治疗靶标的价值。

图5 CTSZ对人肺动脉内皮细胞功能影响的siRNA操作

图5展示了在hPAECs（人肺动脉内皮细胞）中通过siRNA技术敲低（Knockdown）CTSZ表达后对细胞功能影响的实验结果。实验中应用了不同的处理条件，以考察CTSZ基因表达改变对细胞凋亡、活性和增殖的影响。

图5a：在hPAEC细胞中敲低CTSZ表达后，使用不同处理（TNF-α或脂多糖）来检测凋亡酶活性。

图5b：检测hPAEC细胞在敲低CTSZ表达后的细胞活性。实验发现，在CTSZ敲低的hPAEC细胞中，caspase-3/7的活性显著增加，表明细胞凋亡增多。这是通过将细胞暴露于炎症相关刺激物，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和脂多糖(LPS)后观测得到的结果。这表明在CTSZ表达减少的情况下，hPAEC对炎症刺激更为敏感。

图5c：通过Annexin V细胞表面结合和DNA泄漏检测凋亡和坏死。在测量细胞活性方面，CTSZ敲低后的细胞显示出与对照细胞相似的生存能力，意味着仅失去CTSZ并没有显著影响这些细胞的生存。

图5d：通过检测Annexin V表面结合和细胞核DNA泄露来确定的细胞凋亡和坏死同样呈现在敲低CTSZ表达的细胞中增加。

图5e：Western blot和qPCR确认hPAEC细胞中敲低CTSZ表达的效果。结果显示CTSZ的失去并未显著改变由VEGF驱动的hPAEC的增殖率。

图5f：通过免疫印迹（Western Blot）和定量PCR（qPCR）确认了hPAEC细胞中CTSZ敲除的效率。

图5总体上演示了CTSZ在肺动脉内皮细胞中重要的生物学功能，特别是在炎症刺激后细胞凋亡反应的变化。CTSZ的减少与敏感于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和脂多糖诱导的增强凋亡相关。这暗示CTSZ可能在维持肺动脉内皮细胞的正常功能以及在PAH发病中起保护性作用方面发挥作用。这个发现与此前的观察结果一致，即在PAH患者中CTSZ甲基化增加和相应的CTSZ基因表达降低。

总结

本研究是首次在PAH患者的全血样本中进行广泛的甲基化分析，并识别出与PAH显著相关的三个CpG位点，值得特别强调的是，最显著的位点位于CTSZ基因附近。研究人员讨论了CTSZ在PAH中的作用，指出其促进凋亡的功能，这可能是PAH病理变化的早期事件。研究提供了直接证据，表明CTSZ与PAH有密切的关系，并强调PAH中CTSZ表达的变化可能与其CpG位点的甲基化水平有关。

本研究还提及CTSZ与多种癌症进程的相关性，以及其通过与细胞外基质和整合素作用的非催化活性与疾病进展相关联的方式。提到CTSZ对于VEGF介导的内皮功能有抑制作用。此外，研究强调了PAH病理中组织蛋白酶S的角色，并提到了CTSZ在药物研发上的潜在应用。

研究者们讨论了疾病早晚期CTSZ不同调节模式与其甲基化水平的关系，晚期可能由于炎症反应和其他因素导致CTSZ水平升高。研究还探讨了针对PAH疾病特征的其他生物标记物的可能性，以及这些生物标记物如何可能与CTSZ水平相关。

对于表观遗传研究和GWAS的对比，研究者们讨论了EWAS设计和分析方法的局限性和改进空间。他们强调了考虑选项偏见和混杂因素的重要性，并指出需要在疾病相关组织中对全血的发现进行验证。

这项研究成果对未来的研究方向具有重要意义，尤其是在基于血液样本的表观遗传学变化对PAH的影响和潜在的疗法研发方面。研究结果也暗示了cathepsin家族，尤其是CTSZ可能作为一个新的药学靶点，为PAH的治疗提供有希望的新途径。

Illumina因美纳 Methylation BeadChip支持表观遗传学领域的突破性研究已有十余年，迄今为止大多数已发表的全表观基因组关联研究（EWAS）都是利用MethylationEPIC或其前代产品HumanMethylation450完成的。在此项研究中，科学家们亦是采用了MethylationEPIC对样本进行了甲基化检测。

2022年Illumina因美纳发布了甲基化芯片产品的升级版本Infinium^TMMethylationEPIC v2.0 BeadChip。全新上市的EPIC v2.0 BeadChip靶向人类甲基化组最具生物学意义的区域中超过935,000个CpG位点，同时在其前代产品MethylationEPIC v1.0的基础上极大的提高了向后兼容性。该芯片保留了以单核苷酸分辨率定量分析全基因组CpG的能力，同时提供高度准确和精确的甲基化测量，不受测序深度的影响。可使用精简、用户友好的Infinium甲基化检测分析多种DNA样本类型，包括从FFPE分离的DNA样本。与其他方法相比，MethylationEPIC v2.0具有可扩展性和更低的单个样本总成本，因此可用于筛选大型队列，发现关于疾病机制的有影响力的生物学见解。

本论文的原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-44683-0#Sec15

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