基于mRNA的药物和疫苗的快速发展及其广泛应用，标志着生物治疗领域的一次重大变革。尽管mRNA疗法展现出极大的治疗潜力，但其安全性和潜在的毒性问题不容忽视。近日，《自然》杂志子刊Nature Reviews Drug Discovery发表了一篇综述文章，深入分析了mRNA疗法相关的毒性问题，着重讨论了脂质纳米颗粒（LNP）的结构和制造工艺、给药方式以及目前用于消除mRNA制剂潜在风险的方法和新兴策略。今天，药明康德内容团队将为读者解读该综述中的精彩内容。
与传统治疗手段相比，mRNA技术展现出其独特的优势，例如其快速生产的能力以及适用于广泛疾病的潜力。然而，随着该技术在临床治疗中的日益普及，它的安全性问题逐渐成为研究和应用的焦点，尤其是关于潜在毒性风险的管理与解决策略。随着mRNA技术在临床应用范围的不断扩大，迫切需要解决这些安全性挑战，以保障mRNA技术的长期可持续发展。
mRNA治疗的关键步骤之一是通过体外转录（IVT）技术合成mRNA序列。这个过程通常涉及使用噬菌体RNA聚合酶来催化线性化的质粒DNA与核糖核苷酸的结合，从而产生RNA转录产物。然而，这种方法产生的未经修饰的mRNA分子（即IVT mRNA）面临着高免疫原性和低细胞内递送效率的挑战。mRNA临床应用的成功归功于两个领域的重要进展：一是采用化学修饰等策略降低IVT mRNA的免疫原性；二是开发LNP等高效递送系统，确保mRNA能够有效地递送至细胞内。这两项进展共同推动了mRNA疗法的发展，使其成为一种前景广阔的治疗策略。IVT mRNA能够结合并调节Toll样受体3（TLR3）的表达，从而激活NF-κB并引起下游炎症因子的转录上调。未经特定化学修饰的IVT mRNA还可以激活TLR7或TLR8，引发促炎细胞因子的产生，并诱导CD4+和CD8+ T细胞的初级免疫应答。除了上述途径，这些未经修饰的IVT mRNA还可能通过非TLR的模式识别受体触发免疫反应。为了使IVT mRNA在临床应用中具有更佳的安全性和效果，消除其潜在的异常免疫原性是关键一步。研究显示，通过引入核苷甲基化和伪尿苷等化学修饰，可显著降低体外转录单链RNA（IVT ssRNA）的免疫原性。这些化学修饰能够在树突状细胞中减少炎症因子的分泌，并避免激活相关炎症通路，从而降低了未经修饰的ssRNA分子可能引发的免疫反应。此外，这些化学修饰还有助于提高治疗性mRNA的功效。除了上述技术手段，在mRNA纯化过程中去除双链RNA（dsRNA）杂质也是提升mRNA的稳定性并减少其免疫原性的一项关键步骤。而采用特定的核苷酸修饰技术，如添加poly（A）尾和进行2′-O-甲基化核糖修饰，也可以进一步增强mRNA分子的稳定性，并有效降低其免疫原性。此外，为了解决线性mRNA在细胞内较短的半衰期问题，研究人员还提出了包括环状mRNA在内的新型体外RNA工程技术。这些技术不仅延长了mRNA的细胞内存活时间，还通过降低免疫原性和提高蛋白表达效率，为mRNA的治疗应用提供了更为坚实的基础。细胞递送是实现高效mRNA治疗的关键，然而，长链mRNA分子由于其较大的尺寸和负电荷，难以快速穿透磷脂双分子层。此外，mRNA在细胞内和血液中容易被核糖核酸酶降解。为克服这些挑战，研究人员采用LNPs作为载体来保护mRNA，以提高其稳定性、细胞摄取能力和蛋白质翻译效率。典型的LNP配方包括可电离脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇和辅助脂质（helper lipid），这些成分共同影响LNP的活性和稳定性。此外，由于LNP自组装是由静电相互作用和脂质两亲性推动的，最终形成的LNP特性（如大小、表面电荷和组成）取决于脂质比例和脂质分子的特性。随着研究人员对RNA生物学和LNP工程学的理解不断加深，mRNA药物的药代动力学和药效学得到了显著改善。mRNA药物的给药途径与其预期用途和相关疾病的病理生理特征密切相关。为了适应不同的给药途径，必须调整制剂的参数（例如粒径和脂质成分），以优化其生物药剂学属性，特别是针对特定器官的亲和力。目前，mRNA药物主要采用的给药方式包括：在临床试验中，肌肉内和肿瘤内给药方式占主导地位，它们同时也是癌症免疫疗法的首选给药途径。研究表明，通过肌肉内注射的mRNA疫苗能够激发关键的免疫反应。在注射LNP-mRNA复合物后，树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞会聚集到注射部位，导致局部发生暂时性的炎症反应，这种反应相较于皮下给药而言通常较为轻微。此外值得注意的是，LNP-mRNA疫苗中的可电离脂质具有佐剂性，在动物模型研究中被发现能促进IL-6的产生、特异性CD4+ Tfh细胞以及生发中心B细胞的分化。这表明可电离脂质本身（而非mRNA）可能通过刺激先天免疫系统来发挥佐剂作用。然而，还有研究显示mRNA有效载荷本身也具有佐剂性，能够在动物模型中诱导强烈的CD8+ T细胞响应。这些发现表明，LNP-mRNA疫苗的佐剂性和免疫原性可能依赖于脂质和核酸组分，而它们潜在的免疫刺激协同作用还需进一步探究。皮内给药能有效激活朗格汉斯细胞和树突状细胞，增强免疫反应。研究表明，与电穿孔技术相比，mRNA的皮内给药具有更高的转染效率，并能促进淋巴生长，有助于治疗淋巴水肿。此外，皮下给药也能够诱导强烈的细胞毒性T细胞免疫反应，对黑色素瘤模型中的小鼠展示出疗效。mRNA药物通过静脉给药后，主要在脾脏和肝脏中分布。肝脏的独特生理特征，如高血流量和小容积窦状血管，促使LNP-mRNA颗粒被肝细胞及非实质细胞吸收，使得肝脏成为主要的被动靶向部位。然而，这也限制了LNP-mRNA颗粒在肝脏外的生物分布。鉴于mRNA的短半衰期，为了维持其治疗效果，可能需要周期性重复给药。LNP-mRNA制剂可能激发免疫原性反应，在无法通过抗炎药物避免或抑制这类免疫反应的情况下，关键在于如何管理这些免疫反应，以避免重复给药引发的慢性炎症。重复给药的聚乙二醇（PEG）化纳米药物制剂面临的一个问题是加速血液清除（ABC）现象，该现象可能削弱药物的药代动力学特性。ABC现象的机制涉及首次给药后针对PEG成分产生IgM抗体，这些IgM抗体介导的补体激活会增强颗粒的吞噬作用，尤其是在肝脏中，这可能导致LNP-mRNA制剂在肝脏中的半衰期缩短和生物分布增加。因此，在设计LNP-mRNA制剂时，需要考虑PEG成分与预期用途和给药方案的匹配度，以规避这些潜在问题，并确保制剂的长期安全性和有效性。4.口服给药
尽管口服给药因其较高的患者依从性而备受青睐，但在LNP-mRNA疗法领域，这种给药方式的开发利用仍然不足。口服给药面临的一项重要挑战是胃液的酸性环境，这可能导致可电离脂质的质子化，从而在胃肠道内过早地释放mRNA载荷，使其被核酸酶降解。此外，即便LNP-mRNA颗粒能够在胃的酸性环境或胃肠道中的脂解酶和酯酶的作用下保持其结构的完整性，其在生物体内的可用性仍受到肠道上皮细胞表面粘液糖蛋白层的限制。一些临床前研究探索了利用微针技术进行皮内给药的策略，以保护mRNA免受RNA酶的破坏，同时减少不良反应的发生。实验结果表明，装载mRNA的可溶性聚合物微针和中空微针在增强疫苗的免疫原性方面表现出卓越性能。聚肌氨酸作为PEG的替代物，能够有效减少对PEG化脂质的不良免疫反应，并能与RNA形成具有可调电荷特性的纳米颗粒。此外，聚肌氨酸-脂质共轭物与mRNA形成的复合物能够实现与PEG化LNP-mRNA制剂相似的蛋白表达水平，同时具有更优的安全性，包括较低的炎症性和肝脏毒性。为了规避LNP-mRNA药物的潜在安全风险，当前可用的策略包括系统化合成和筛选可电离脂质、实施组合疗法、最小化脱靶效应以及开发环状mRNA等。这些策略共同为mRNA疗法的安全性与有效性奠定了坚实的基础。可电离脂质在LNP-mRNA制剂中发挥关键作用，其头部基团通常具有低解离常数，有助于促进LNP-mRNA结构在内体中解聚，而碳氢尾部结构则促进mRNA释放至细胞质。利用组合化学策略可以快速合成并筛选新脂质，以优化转染效率并降低毒性。研究发现，通过与其他药物或佐剂联合给药，可以增强mRNA药物和疫苗的治疗效果并降低其治疗风险。例如在一项临床前研究中，通过将编码IL-12、IL-27和GM-CSF的LNP–mRNA与裸露的IL27 mRNA联合给药，能显著抑制小鼠黑色素瘤模型中的肿瘤生长，其效果是单独使用LNP–mRNA的十倍。另一项研究中，编码粘蛋白1（mucin-1）的LNP–mRNA与CTLA-4单抗联合给药，激活了小鼠模型中的肿瘤特异性T细胞，并显著抑制了肿瘤生长，其效果超过了单独LNP–mRNA治疗。在化疗过程中，使用免疫抑制剂已是标准做法，这一策略对于基于核酸的治疗同样适用。例如，将地塞米松整合到装载编码荧光素酶mRNA的LNP中，可以在小鼠中降低细胞因子的产生，并且不引发急性体外细胞毒性。在另一项研究中，为了缓解患有转甲状腺素淀粉样变性的患者可能出现的系统性先天免疫反应，在施用基于LNP的CRISPR-Cas9基因编辑治疗前，研究人员会先行给予糖皮质激素和抗组胺药。此外，JAK抑制剂和依达拉奉等其他小分子药物也被发现可以有效减轻与脂质相关的不希望的免疫原性。这些研究结果突显了联合治疗策略在增强mRNA药物和疫苗疗效方面的潜力。研究表明，通过化学工程手段调节脂质的pKa值，可以调节LNP包裹的siRNA在肝内细胞的趋向性。为降低mRNA疗法开发中的脱靶效应，研究人员采取了两种策略：一是借助内源性微小RNA（miRs）特异性地抑制mRNA翻译，其次通过优化LNP-mRNA复合物的器官特异性摄取，提高其在目标器官中的利用效率。特别是，LNP-mRNA技术的最新进展使得非肝脏器官靶向成为可能，同时也改善了肝脏内细胞趋性，这进一步降低了潜在的脱靶效应。具体而言，通过引入永久带电的脂质以调控LNP的生物分布，可以实现对特定器官如肺、脾或肝脏的偏好性靶向。另有研究探索了采用鞘磷脂调节LNP-mRNA生物分布的策略，该策略通过延长纳米粒子在小鼠体内的循环时间，改善了LNP-mRNA的肝外分布。进一步的研究还揭示了通过化学工程技术调整脂质的pKa值，可以精细控制LNP包裹的siRNA在肝脏内不同细胞类型之间的分布，为提高治疗的靶向性和降低脱靶效应提供了一种有效途径。这些策略的综合应用不仅有望增强mRNA治疗的精准性，也为降低潜在的脱靶效应提供了重要的科学依据。mRNA疫苗的研发成功标志着生物治疗领域的一个重大转折点，医药行业正越来越多地利用mRNA技术来开发针对罕见病、癌症及感染性疾病的创新药物。药物开发的成功在很大程度上取决于其安全性，然而降低mRNA疗法的安全风险并不是一件简单的事。LNP包裹的IVT mRNA作为一个多组分实体，其整体生物活性可能并不仅仅是其各个组分的加合。LNP-mRNA制剂的药理作用和潜在毒性不仅与其颗粒特性相关，也与脂质化学及mRNA翻译产物紧密相关，独立调整任一参数而不影响其他因素，是一项重大的挑战。鉴于LNP-mRNA制剂的复杂性，其临床前开发需要采用跨学科策略，整合纳米技术、生物化学、药理学及组织工程等领域的技术。在研发复杂组分的mRNA疗法时，须采用超越传统小分子药物开发的先进技术，这包括开发能更准确反映人体生理和病理状态的研究模型，应用人工智能指导的药效学模型和毒性基因组网络来提升数据解读的质量。此外，单细胞技术的应用极大地丰富了研究者对体外和离体单细胞的药物反应异质性的理解。具体而言，通过结合下一代测序、DNA条形码和单细胞RNA测序等技术，研究人员能够准确识别在体内优先靶向特定细胞亚型的LNP-mRNA组合。此外，单细胞技术还可帮助优化LNP-mRNA制剂，确保药效学特性符合预期，并辨别不良反应是否为组织特异性，从而及早采取干预措施。综上所述，开发基于mRNA的疗法需要综合多学科方法，包括利用体外毒性筛选、组学数据分析以及实时追踪LNP和mRNA技术进展，这对于降低mRNA疗法研发风险、减少项目的淘汰率具有重要意义。参考资料 ：Bitounis, Dimitrios et al. “Strategies to reduce the risks of mRNA drug and vaccine toxicity.” Nature reviews. Drug discovery, 10.1038/s41573-023-00859-3. 23 Jan. 2024, doi:10.1038/s41573-023-00859-3主编微信
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