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【模板】做基因型与疾病关联研究的五步法;他们据此发表在Nature,你也可以借鉴

【模板】做基因型与疾病关联研究的五步法;他们据此发表在Nature,你也可以借鉴


Bringing medical advances from the lab to the clinic.

关键词:科研方法;基因型-表型;Nature

基因型变异是导致特定疾病风险的关键因素。然而,在基因组和表型间建立确切的关联一直以来是个重大的挑战。

2024年4月3日,Nature杂志发表了一篇非常好的总结性文章【1】,通过介绍近期发表于Nature一篇高质量的基因变异-冠心病论文【2】,整理成一个系统的方法,有效地识别与基因型变异相关的基因和分子通路。

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人类基因学研究已经揭示了300多个基因组区域(基因座)包含与冠状动脉疾病风险相关的基因序列变化(变异)。其中部分变异可能影响血管内壁内皮细胞的功能。然而,要甄别哪些变异作用在内皮细胞上、以及这些变异如何改变基因通路来影响疾病风险,一直以来都非常困难。大部分变异位于非蛋白质编码区域的基因组上,可能调控附近的众多基因和下游的分子通路。因此,目前相关研究进展零散,通常需要逐一研究单一的变异。而这样的局限性正是人类基因学领域面临的问题:如何建立基因变异与它所控制的基因及通路之间的关系,继而深刻理解人体生物学机理与疾病风险

解决方案
在基因变异-冠心病的研究中,研究者给出的解决之道是:先建立一个包含疾病相关细胞类型中所有基因通路的目录,并对该目录中的每个通路进行检测,看候选疾病变异和基因是否存在于其中。由此建立了一套结合实验与计算分析的混合方法(图1)来系统性研究内皮细胞中对冠状动脉疾病有风险的基因变异。
🔺 图1 |  从变异到基因再到通路的分析方法 (V2G2P)
红色节点展示了全基因组关联研究(GWAS)中识别出的不同区域中的风险变异如何汇聚到相对少量与疾病相关的细胞特异性通路中。
在“从变异到基因”的步骤中,研究者使用“按接触作用”(ABC)模型将非编码变异链接到附近的基因,从而建立一个风险变异至候选靶基因的图谱。
在“基因到通路”的步骤中,研究者采用CRISPR干扰技术(CRISPRi)和单细胞扰动测序(Perturb-seq)来研究所有GWAS基因座中的候选基因,建立貌似共同作用在分子通路中的基因图谱。
最后,研究者使用一个统计检验(V2G2P富集测试)来识别与许多GWAS变异有关的分子通路,并对这些通路进行详细研究。

具体,作者总结了“从变异到基因再到通路”的方法(V2G2P)有五个步骤。
  • 第一步是选择与疾病相关的细胞类型。
  • 在第二、第三步中,使用基因组方法来建立连接风险变异与潜在靶基因、以及这些基因与分子通路的图谱。
  • 在第四步,结合这些变异到基因、基因到通路的图谱来检验与风险变异有关的基因是否存在于某条特定的通路。
  • 最后,研究这些通路的分子细节。

本研究的关键技术之一是使用了单细胞扰动测序(Perturb-seq)技术来同时研究所有的候选基因。其原理是先通过CRISPR干扰技术——一种有针对性地编辑表观基因组的技术(细胞DNA上或相关组蛋白的生化修饰),在每个细胞中随机敲低不同的基因;然后使用单细胞RNA测序来观察基因敲低对细胞通路的影响。Perturb-seq 使研究者能够从头开始以一种无偏的方式建立内皮细胞中基因通路的目录。

研究者发现,许多与冠状动脉疾病有风险的变异都与一组基因相连,而这组基因已知会影响大脑海绵状血管畸形(CCM,一种罕见的血管神经系统疾病)的风险。这些基因之前并没有被认为与冠状动脉疾病相关。在体外敲低这条CCM通路中的基因会导致动脉内皮细胞呈现出类似于对体内血流做出反应时的分子特征--血管健康的标志。
有趣的是,这条通路中一个重要的调控基因是TLNRD1,而该基因在内皮细胞中的功能之前并没有被描述。由此,TLNRD1现在被认为是CCM信号通路的一个元件,而且这条通路从斑马鱼到人都高度保守。该研究共在内皮细胞中共发现了41个与CCM通路相关的基因,表明这条通路是决定冠状动脉疾病风险的一个关键机制。它还可能成为一个治疗靶点。

编者按:
本研究首先将大脑海绵状血管畸形(CCM)通路与冠状动脉疾病的风险联系在一起。研究者发现,虽然CCM通路基因的大段缺失会导致大脑静脉内皮细胞的CCM,而常见的能部分降低这些基因活性的基因变异预计能降低动脉内皮细胞中的冠状动脉疾病风险。
为进一步的工作来确定这些基因对细胞表型和疾病风险的影响,研究者通过Perturb-seq结果提供了一组优先级较高的基因,应当在动物动脉粥样硬化模型和冠状动脉疾病的临床研究中进行测试。

科研借鉴价值:
这项研究提供了一个新思路,可以利用人类遗传学数据来揭示疾病风险背后的分子机制。
期望这种方法也能普遍适用于其它的常见疾病和细胞类型。

鉴于这项研究做到非常精巧的设计,这篇论文的审稿人特别给出了专家意见:
作者们展示的大量工作值得表扬。他们巧妙利用GWAS数据,结合精心设计的单细胞RNA测序和可及染色质测序转座酶测序(ATAC-seq),并使用高通量CRISPR干扰技术。这使得不论是静息状态还是诱发状态下,具有共享关系的基因识别都成为可能。这个方法很有趣,有望让我们更好地识别非编码基因、变异、以及GWAS基因座背后的功能性通路。

科研建议:
强烈建议其他临床医生在基因型和疾病关联研究中采用V2G2P方法。它提供了一个系统框架来识别可能影响疾病风险的基因和分子通路。具体步骤如下:
  1. 选择疾病相关的细胞类型: 着重研究与目标疾病病理高度相关的细胞类型,例如冠状动脉疾病研究中的血管内皮细胞。
  2. 从变异到基因: 使用ABC模型或类似的计算方法来建立一个连接非编码变异与潜在靶基因的图谱。
  3. 从基因到通路: 利用CRISPRi和Perturb-seq这样的技术,同时研究大量候选基因并绘制分子通路图谱。
  4. 识别相关通路: 应用V2G2P富集测试来找出与疾病风险变异相关的生物学通路。
  5. 分子机理探究: 对最相关的通路进行详细研究来阐明基因变异如何影响疾病的发展。
V2G2P方法可能成为发现疾病的新型治疗靶点和生物标志物的强有力工具,最终促进个性化医疗的发展。

参考文献:
【1】 https://www-nature-com-s.webvpn.cams.cn/articles/d41586-024-00061-4
【2】 Schnitzler GR, et al. Convergence of coronary artery disease genes onto endothelial cell programs. Nature. 2024 Feb;626(8000):799-807. doi: 10.1038/s41586-024-07022-x. Epub 2024 Feb 7. PMID: 38326615; PMCID: PMC10921916.

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来源:Hanson临床科研

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