Nat Commun | “形似火箭”可高效递送mRNA的新型支链类脂质，实验已显示出显著优势

信使核糖核酸（mRNA）技术在治疗和预防癌症、传染病、代谢紊乱和先天性疾病等多种疾病方面大有可为。

事实上，基于 mRNA 的技术已在疫苗、蛋白补充疗法和基因编辑疗法方面取得了临床成功。具体而言，两种mRNA疫苗(即Spikevax®和Comirnaty®)已获得美国食品药品管理局（FDA）批准用于预防COVID-19。mRNA 是一种带负电荷且不稳定的大分子，需要载体才能在细胞内有效递送。

脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）是临床上最先进的 mRNA 非病毒递送平台。LNP 通常由可离子化脂质（ionizable lipid）的类脂质（lipidoid）、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）共轭脂质组成。类脂质在保护和运输 mRNA 货物方面起着关键作用。在酸性 pH 值下，类脂带正电荷，可在 LNP 制备过程中浓缩mRNA，并在细胞内化过程中破坏内体膜。

在生理 pH 值下，类脂质保持中性电荷，从而限制了毒性并改善了 LNP 的药代动力学特性。类脂质通常包含一个可电离的头基和两个（或多个）烷基尾部，并且这两者通过接头（linker）连接起来。

值得注意的是，类脂质中优先使用可降解接头（主要是酯键），以便在体内水解，提高生物相容性。此外，支链烷基尾部也很受欢迎，因为这些尾部可促进类脂质形成锥形结构，从而有利于内体逃逸和 mRNA 递送。

最近，Harashima 等人进行了一项基于机理的研究，进一步表明支链烷基尾部可增强LNP的稳定性、电离能力和功效。值得注意的是，在已获批的 COVID-19 mRNA 疫苗中成功使用了两种类脂质，它们都具有可降解的酯键和支链烷基尾部，进一步验证了这些结构参数在有效类脂质设计中的优点。

然而，由于缺乏商业上可用的支链结构单元（branched building block），合成具有延伸烷基分支的可降解类脂质是困难的，这阻碍了对它们的系统优化和研究。

在以往的研究中，这些类脂质的构建完全基于两个主要步骤：第一，制备含有官能团（如溴基、醛基、丙烯酸酯基、羟基和羧基）的支链尾部中间体；第二，将支链尾部连接到头基。这种构建方法通常涉及繁琐的合成和纯化，因此难以系统地优化这些化学结构和研究结构-活性关系（structure-activity relationship）。

基于此，美国宾夕法尼亚大学Michael Mitchell团队（第一作者韩雪祥博士现为中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员）想要开发新的构建方法，利用现成的支链结构单元快速、经济、高通量地合成可降解的支链类脂质。

为此，他们设计了一种基于一锅两步三组分反应（3-CR）的串联和原位组合合成可降解支链（degradable branched, DB）类脂质的构建策略。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“In situ combinatorial synthesis of degradable branched lipidoids for systemic delivery of mRNA therapeutics and gene editors”。

在这种设计中，两个支链尾部通过可降解接头被原位添加到含有两个短体尾部的低效氨基醇类脂质上，从而极大地促进了 mRNA 递送。他们通过改变头基结构、短体尾部长度和支链尾部长度，系统地合成并筛选了两个 DB类脂组合文库（1和2）。

经鉴定，多种 DB类脂质能形成用于体内 mRNA 递送的强效 LNP，其效率与已获准用于肝脏递送小干扰 RNA（siRNA）的基准 DLin-MC3-DMA (MC3) LNP制剂相当，甚至更高。此外，还确定了涉及总碳数、对称性和头基的关键结构标准，这些标准可用于预测未确定的 DB 类脂质的性能。

DB类脂质的构建以及DB-LNP介导的mRNA递送

图片来自Nature Communications, 2024, doi:10.1038/s41467-024-45537-z

为了证实他们合成的 DB 类脂质（比如11-10-8 LNP）在基于 mRNA 的基因组编辑疗法和蛋白补充疗法中的潜力，他们与已获批准的基准 DLin-MC3-DMA (MC3) LNP制剂进行了正面比较。

通过肝脏递送 Cas9 mRNA/sgRNA，对转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）和人成纤维细胞生长因子 21（FGF21）编码的 mRNA 进行基因编辑展示了他们的先导 DB 类脂质在治疗肥胖和脂肪肝中的效用。值得注意的是，与 MC3 LNP 相比，他们的 11-10-8 LNP 使TTR基因组编辑效率和治疗性 FGF21 蛋白表达量提高了约五倍。

此外，与基于 MC3 LNP 的 mRNA 疗法相比，基于 11-10-8 LNP 的 FGF21 mRNA 疗法表现出更优越的减重和降脂效果，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中显著减轻了肥胖和脂肪肝。

有趣的是，虽然 11-10-8 LNP 比 MC3 LNP 更为强效地递送 mRNA，但它们递送 siRNA 的效力却不相上下。其他人也观察到了类似的结果，优化的 LNP 制剂可使 mRNA 转染量增加七倍，但并不能增强 siRNA 的转染。据推测，siRNA 比 mRNA 更容易受LNPs的影响。尽管如此，与 MC3 LNP相比，11-10-8 LNP易于合成且成本低廉，在 siRNA 递送方面仍具有优势。

这项新的研究存在一些局限性。首先，为了便于对尾部区域进行结构-活性关系分析，DB类脂组合文库1中仅使用了饱和和线性环氧化物及酰基氯。值得一提的是，根据这些作者的构建方法，使用不饱和或支链环氧化物和酰基氯也是可行的，这可以进一步增加 DB 类脂质化合物的结构多样性。

其次，为了简化对头基的结构-活性关系分析，DB类脂组合文库2 只选择了可以连接两个体尾部的胺，而排除了可以连接多个体尾部的复杂胺（如多胺和树枝状聚合物）。第三，虽然与 MC3 LNP 相比，他们合成的强效 DB-LNP 的体内 mRNA 递送能力更强，但它们的体外表现却不如 MC3 LNP。体外和体内结果不一致的原因目前还不清楚。尽管如此，他们仍在进一步探索支链类脂质，了解它们在体内的效力。

总之，这些作者设计了一种构建方法，可实现 DB 类脂质的高通量和低成本合成。通过对这两个DB类脂组合文库进行组合合成和筛选，他们发现了多种强效 DB类脂质化合物，并总结了影响药效的关键结构标准，这些标准可用于预测未发现的类似物的性能并指导发现强效类似物。

他们合成的先导 DB 类脂质在肝脏 mRNA 递送方面优于MC3 LNP，显示了它们在基于 mRNA 的蛋白补充疗法和基因编辑疗法方面的巨大潜力。因此，他们的构建方法降低了合成支链类脂质的门槛，从而为进一步开发和应用支链类脂质递送 mRNA 奠定了基础。

参考资料：

Xuexiang Han et al. In situ combinatorial synthesis of degradable branched lipidoids for systemic delivery of mRNA therapeutics and gene editors. Nature Communications, 2024, doi:10.1038/s41467-024-45537-z.