Nature：剑桥大学团队，揭示脂肪肝患者肝细胞再生特征

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5月前

Bringing medical advances from the lab to the clinic

关键词：代谢功能障碍相关脂肪性肝病；细胞再生；Nature

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对于许多成年人体器官来说，慢性病期间的组织再生仍然是一个有争议的话题。再生过程在动物模型中很容易观察到，其潜在机制也越来越明确，但技术挑战和伦理方面限制了这些结果在人类中的验证。

研究者决定解决肝脏方面的这一难题。该器官在急性损伤后表现出显著的再生能力，尽管在反复损伤的情况下肝脏再生仍有待充分证明。

2024年5月22日，剑桥NIHR生物医学研究中心Michael Allison、剑桥大学Wellcome-MRC剑桥干细胞研究所Irina Mohorianu和Ludovic Vallier等在Nature杂志在线发表题为“Acquisition of epithelial plasticity in human chronic liver disease” 的论文，揭示人慢性肝病中上皮可塑性的获得【1】。

该研究中研究者对47例不同阶段的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者的肝脏活检进行了单核RNA测序（snRNA-seq），以建立疾病进展过程中肝脏的细胞图谱。

然后，研究者将这些单细胞水平的数据与先进的3D成像相结合，以揭示肝脏结构的深刻变化。肝细胞失去了它们的分带性，胆管树发生了相当大的重组。

更重要的是，该研究揭示了在没有成年干细胞或发育祖细胞激活的情况下，肝细胞和胆管细胞之间发生的转分化事件。

使用胆管细胞类器官进行的详细分析和功能验证证实了PI3K–AKT–mTOR通路在这一过程中的重要性，从而将这种可塑性的获得与胰岛素信号传导联系起来。

总之，研究者的数据表明，慢性损伤创造了一种诱导人体器官细胞可塑性的环境，了解这一过程的潜在机制可以为慢性疾病的管理开辟新的治疗途径。

研究主要结果

成年器官再生的能力已经在动物模型中得到了很好的证明，结合谱系追踪实验的功能研究表明，不同的损伤诱导不同的再生过程。然而，由于技术和伦理原因，很难证明人类器官中存在此类事件。

在这种情况下，肝脏是一个特别有趣的器官。

肝上皮中的主要功能细胞类型是肝细胞和胆管细胞，肝细胞以其代谢作用而闻名，胆管细胞排列在胆管树上并运输胆汁酸。损伤后这些细胞被替换的过程取决于所遇到的损伤。细胞增殖发生在急性肝损伤期间，但这种增殖能力在慢性疾病中被消除。

动物研究揭示了三种替代机制：干细胞或祖细胞可以被激活，然后分化为上皮细胞；胆管细胞可以转分化为肝细胞，反之亦然；或者肝细胞和胆管细胞可以逆转为发育祖细胞以恢复相应的细胞隔室。

这些机制的迹象已经在人类身上观察到，但慢性肝病期间发生的再生过程的性质仍有待充分了解。

为了解决这个问题，研究者将单核分析、3D成像和功能实验相结合，研究了MASLD进展过程中发生的细胞行为和再生过程，MASLD是一种影响全球越来越多人口的慢性肝病。

MASLD是一种进展性疾病，始于肝细胞中脂肪的积累。随着时间的推移，这种积累会导致细胞死亡，导致炎症、纤维化、肝硬化和肝衰竭或癌症。

研究者首先评估了受进行性MASLD影响的肝脏是否显示出再生过程的证据。为此，研究者进行了免疫染色，将健康肝脏的组织切片与处于疾病进展不同阶段的人的活组织切片进行了比较。

主要变化是明显的，尤其是在终末期疾病患者的肝脏中，预期会出现含有肝细胞的再生结节（由肝细胞标志物ALB指示），周围有大量胶原沉积。胆管细胞标志物角蛋白7（K7，也称KRT7）和角蛋白19（K19，也称KRT19）的免疫染色显示，这些结节周围的导管结构强烈增加，这一过程被称为导管反应，常见于急性和慢性肝病。

这些实验还揭示了共表达K7和肝细胞标志物ALB或HepPar1的细胞。这些可能代表中间肝细胞，已经在人类MASLD中进行了组织学观察。

然而，研究者也观察到共表达ALB、K7和K19的细胞，这些细胞似乎特异性存在于终末期肝脏中，表明存在结合肝细胞和胆管细胞表型的细胞。重要的是，这种双表型细胞与再生过程有关，因此它们的出现可能预示着终末期MASLD的上皮再生。

为了进一步研究导致双表型细胞出现的事件及其在疾病中的作用，研究者决定在单细胞水平上研究MASLD的进展。

为此，研究者收集了47名MASLD进展不同阶段的人的肝脏活检，这些阶段的组织学定义为健康、MASLD、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、肝硬化和终末期疾病。一半的活检被分配用于诊断和分期工作，另一半被快速冷冻以在后期进行处理。然而，正如之前的研究所示，研究者很快就放弃了使用从新鲜活检中分离的细胞，因为使用这种方法会丢失许多肝细胞和胆管细胞。为了绕过这一限制，研究者开发了一种涉及组织裂解和荧光激活细胞分选（FACS）的细胞核分离方案，该方案甚至可以从纤维化组织中纯化高质量的细胞核。

使用该方案，在质量控制后分离出不到100,000个细胞核，其中排除了表达线粒体和核糖体蛋白等应激标志物的细胞。

进一步的分析证实，研究者的方法以与天然组织相似的比例捕获了所有疾病阶段的所有预期肝细胞类型。因此，研究者收集的样本富含肝细胞（n=69426）和胆管细胞（n=5,412). 值得注意的是，除肝细胞外，细胞类型特异性簇大多独立于疾病阶段重叠，肝细胞在疾病进展后表现出明显的转录变化，即使在使用Harmony40对技术效果进行批量校正后也是如此。

因此，肝细胞似乎是受该疾病影响最大的细胞类型。

最后，单核分析还揭示了共表达肝细胞和胆管细胞标志物的细胞的存在。

研究者观察到的细胞似乎桥接了肝细胞和胆管细胞簇，并共同表达了这两种细胞类型的特异性标志物。进行质量控制以确认这些细胞不是双重或RNA污染的结果。总之，这些实验表明，单核分离方案与肝活检的单细胞水平转录组分析兼容，并证实了双表型细胞的存在，这些细胞以前与进行性MASLD患者肝脏的再生过程有关。

编者按：

本研究的创新点：

本研究结果表明，转分化可能不是再生中的真实事件。事实上，转分化细胞主要在终末期肝脏中观察到，这些肝脏显示出很少的功能，代表着受损的环境，并且癌症的发病率很高。

但需要注意的是，本研究中观察到的可塑性的获得代表了一种疾病过程，而不是一种修复机制。

肝细胞和胆管细胞周围生态位发生的主要变化强化了这一假设，异常的分带、细胞特性的丧失和胆管树的异常重塑证明了这一点，所有这些都很难与健康的再生过程联系起来。

除此之外，研究者还发现，SOX4、KLF6和KRT23的表达不仅与肝脏脂肪变性和胆道重塑有关，还与肝细胞癌有关。

最后，研究者的数据表明PI3K–AKT–mTOR通路在调节胆管细胞向肝细胞转分化中的作用。

该途径先前与斑马鱼胆汁上皮细胞转化为肝细胞有关，这可能表明该机制在物种之间是保守的。胰岛素信号通路参与可塑性调节也突出了胰岛素抵抗的潜在作用，胰岛素抵抗通常与癌症风险增加有关。

科研启发：

本研究给我们最大的启发无疑是其获得突破性进展的关键技术。

单细胞分析为研究疾病进展的因素提供了先进的资源。

与scRNA-seq相反，snRNA-seq的使用允许无偏地捕获肝细胞和胆管细胞，而不会过度表达免疫细胞，这已在scRNA-seq研究中报道。两种方法对人类肝脏的比较表明，snRNA-seq也提高了罕见人群的检测率。这些好处，加上snRNA-seq适用于处理冷冻活检，使这种方法适合研究者的研究和目标。

该数据集中包含的信息肯定超出了再生机制，随后的分析可能会揭示涉及更多细胞类型的新细胞活动。然而，研究者决定将重点放在再生过程上，因为这一方面很难在人体组织中进行研究，并且可能对进展性疾病靶向的器官产生深远影响。

通过将snRNA-seq与组织的高级成像相结合，研究者发现胆管细胞和肝细胞之间的细胞可塑性随着疾病的进展而增加，最终在终末期疾病中达到顶峰。

这一发现支持了动物研究的结果，这些研究已经报道了胆管细胞到肝细胞的可塑性。

此外，研究者的分析建立在MASLD中中间肝细胞（表达K7的肝细胞样细胞）的组织学观察的基础上，表明转分化细胞，从而真正的双表型细胞，主要在终末期肝脏中发现。

这些双表型细胞与先前鉴定的仅存在于健康组织中的肝胆混合祖细胞不同。此外，研究者没有发现肝干细胞或去分化过程的证据。然而，单细胞数据分辨率可能是一个限制，研究者无法完全排除肝脏中存在罕见的成年干细胞群体。这种细胞可能被其他类型的损伤激活。

数据集的分辨率足以捕捉疾病早期代表导管反应的细胞和中间肝细胞。尽管缺乏可塑性因子的表达，但这些细胞与该研究中鉴定的双表型细胞共享转录特征，因为它们同时表达肝细胞和胆管细胞的标志物。

因此，研究者的数据并不排除导管反应或中间肝细胞可能代表终末期肝脏中产生双表型细胞所必需的早期前体的可能性。

进一步研究：

在肝脏中观察到的可塑性可以反映2型糖尿病MASLD患者的几个器官中发生的更广泛的机制。未来研究胰岛素抵抗和细胞可塑性相互作用的工作可能会解决这个重要问题。

研究者的数据还表明，PI3K–AKT–mTOR途径可能是参与可塑性的各种途径之一。

小结：

人类上皮细胞可塑性的获得很可能是一种疾病机制，涉及多种信号和长期微环境的改变。